Interferencaj faktoroj en PCR -reagoj

Dum la PCR -reago, iuj interferantaj faktoroj ofte estas renkontitaj.
Pro la tre alta sentiveco de PCR, poluado estas konsiderata kiel unu el la plej gravaj faktoroj influantaj PCR -rezultojn kaj povas produkti falsajn pozitivajn rezultojn.
Egale kritikaj estas la diversaj fontoj, kiuj kondukas al falsaj negativaj rezultoj. Se unu aŭ pluraj esencaj partoj de la PCR -miksaĵo aŭ la amplifila reago mem estas inhibitaj aŭ enmiksitaj, la diagnoza provo povas esti malhelpita. Ĉi tio povas konduki al reduktita efikeco kaj eĉ falsaj negativaj rezultoj.
Krom inhibicio, perdo de cela nuklea acida integreco povas okazi pro sendado kaj/aŭ stokaj kondiĉoj antaŭ specimenpreparo. Precipe, altaj temperaturoj aŭ neadekvata stokado povas konduki al damaĝo de ĉeloj kaj nukleaj acidoj. Ĉelaj kaj histaj fiksaĵoj kaj parafina enmetado estas bone konataj kaŭzoj de DNA -fragmentiĝo kaj konstanta problemo (vidu Figurojn 1 kaj 2). En ĉi tiuj kazoj, eĉ optimuma izolado kaj purigo ne helpos.

Figuro 1 | Efiko de senmovigo sur DNA -integreco
Agarosa ĝel -elektroforesis montris, ke la kvalito de la DNA izolita de parafinaj sekcioj de nekropsioj variis konsiderinde. DNA de malsamaj mezaj fragmentaj longoj ĉeestis en la eltiraĵoj depende de la fiksa metodo. DNA estis konservita nur kiam fiksita en denaskaj frostigitaj specimenoj kaj en bufrita neŭtrala formalino. La uzo de forte acida bouin-fiksaĵo aŭ nebuligita, formal-enhavanta formalin rezultigis signifan perdon de DNA. La restanta frakcio estas tre fragmenta.
Maldekstre, la longo de fragmentoj estas esprimita en kilobaseaj paroj (KBP)

Figuro 2 | Perdo de integreco de nukleaj acidaj celoj
(A) 3′-5 ′ breĉo sur ambaŭ ŝnuroj rezultigos paŭzon en la cela DNA. Sintezo de DNA ankoraŭ okazos sur la malgranda fragmento. Tamen, se primara tegmenta retejo mankas sur la DNA -fragmento, nur lineara amplifado okazas. En la plej favora kazo, la fragmentoj povas revivigi unu la alian, sed la rendimentoj estos malgrandaj kaj sub detektaj niveloj.
(b) Perdo de bazoj, ĉefe pro depurigado kaj timidina dimer-formado, kondukas al malpliigo de la nombro de H-ligoj kaj malpliigo de TM. Dum la plilongigita varmiga fazo, la printiloj fandiĝos for de la matrica DNA kaj ne anneal eĉ en malpli striktaj kondiĉoj.
(c) Apudaj timinaj bazoj formas tt -dimeron.
Alia ofta problemo, kiu ofte okazas en molekulaj diagnozoj, estas la malpli-ol-optimuma liberigo de celaj nukleaj acidoj kompare al eltiro de fenol-kloroformo. En ekstremaj kazoj, ĉi tio povas esti asociita kun falsaj negativoj. Multe da tempo povas esti ŝparita per bolanta lizo aŭ enzimata digesto de ĉelaj forĵetaĵoj, sed ĉi tiu metodo ofte rezultigas malaltan PCR -sentivecon pro nesufiĉa nuklea acida liberigo.

Malpermeso de polimerasa agado dum amplifado

Ĝenerale, inhibicio estas uzata kiel ujo -koncepto por priskribi ĉiujn faktorojn, kiuj kondukas al suboptimaj PCR -rezultoj. En strikte biokemia senco, inhibicio estas limigita al la agado de la enzimo, t.e., ĝi reduktas aŭ malhelpas substratan produktan konvertiĝon per interagado kun la aktiva loko de la DNA-polimerazo aŭ ĝia kofaktoro (ekz. Mg2+ por Taq DNA-polimerazo).
Komponantoj en la specimeno aŭ diversaj bufroj kaj eltiraĵoj enhavantaj reaktivojn povas rekte malhelpi la enzimon aŭ kapti ĝiajn koaktorojn (ekz. EDTA), tiel senaktivigante la polimerazon kaj siavice kondukante al malpliigitaj aŭ falsaj negativaj PCR -rezultoj.
Tamen, multaj interagoj inter reagaj komponentoj kaj cel-enhavantaj nukleaj acidoj ankaŭ estas nomumitaj kiel "PCR-inhibidores". Post kiam la integreco de la ĉelo estas interrompita per izolado kaj la nuklea acido estas liberigita, interagoj inter la specimeno kaj ĝia ĉirkaŭa solvo kaj solida fazo povas okazi. Ekzemple, 'Scavengers' povas ligi unu- aŭ duoble-ŝtupan DNA per ne-kovalentaj interagoj kaj intermiksi izoladon kaj purigon reduktante la nombron de celoj, kiuj eventuale atingas la PCR-reagan ŝipon.
Ĝenerale, PCR -inhibidores ĉeestas en plej multaj korpaj fluidoj kaj reagentoj uzataj por klinikaj diagnozaj provoj (ureo en urino, hemoglobino kaj heparino en sango), dietaj suplementoj (organikaj komponentoj, glicogeno, graso, Ca2+ jonoj) kaj komponentoj en la medio (fenoloj, pezaj metaloj)

Pli ĝeneralaj PCR-inhibidores troveblas en bakterioj kaj eŭkariotaj ĉeloj, ne-cela DNA, DNA-ligantaj makromolekuloj de histaj matricoj kaj laboratoriaj ekipaĵoj kiel gantoj kaj plastoj. Purigo de nukleaj acidoj dum aŭ post eltiro estas la preferata metodo por forigo de PCR -inhibidores.
Hodiaŭ diversaj aŭtomataj eltiraj ekipaĵoj povas anstataŭigi multajn manajn protokolojn, sed 100% reakiro kaj/aŭ purigado de celoj neniam estis atingitaj. Eblaj inhibidores povas ankoraŭ ĉeesti en la purigitaj nukleaj acidoj aŭ eble jam efektiviĝis. Malsamaj strategioj ekzistas por redukti la efikon de inhibidores. La elekto de la taŭga polimerazo povas havi signifan efikon sur inhibicia agado. Aliaj provitaj metodoj por redukti PCR -inhibicion pliigas koncentriĝon de polimerazo aŭ aplikante aldonaĵojn kiel BSA.
Malhelpo de PCR -reagoj povas esti pruvita per la uzo de interna proceza kontrolo de kvalito (IPC).
Oni devas zorgi por forigi ĉiujn reaktivojn kaj aliajn solvojn en la eltiro -ilaro, kiel etanolo, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, izopropanolo kaj fenolo, el la nuklea acido izolita per kompleta lavita paŝo. Depende de ilia koncentriĝo, ili povas aktivigi aŭ malhelpi PCR.