Interferfaktoroj en PCR-reagoj

Dum la PCR-reago, kelkaj interferaj faktoroj ofte estas renkontitaj.
Pro la tre alta sentemo de PCR, poluado estas konsiderita kiel unu el la plej gravaj faktoroj influantaj PCR-rezultojn kaj povas produkti malverajn pozitivajn rezultojn.
Same kritikaj estas la diversaj fontoj, kiuj kondukas al malverenegativaj rezultoj. Se unu aŭ pluraj esencaj partoj de la PCR-miksaĵo aŭ la plifortiga reago mem estas malhelpitaj aŭ malhelpitaj, la diagnoza analizo povas esti malhelpita. Ĉi tio povas konduki al reduktita efikeco kaj eĉ falsaj negativaj rezultoj.
Aldone al inhibicio, perdo de celo-nukleacida integreco povas okazi pro ekspedado kaj/aŭ konservadkondiĉoj antaŭ specimena preparado. Aparte, altaj temperaturoj aŭ neadekvata stokado povas kaŭzi damaĝon de ĉeloj kaj nukleaj acidoj. Ĉela kaj hista fiksado kaj parafina enkonstruado estas konataj kaŭzoj de DNA-fragmentiĝo kaj persista problemo (vidu Figurojn 1 kaj 2). En ĉi tiuj kazoj, eĉ optimuma izolado kaj purigo ne helpos.

Figuro 1 | Efiko de senmovigo sur DNA-integreco
Agarose-ĝelelektroforezo montris ke la kvalito de la DNA izolita de parafinsekcioj de nekropsioj variis konsiderinde. DNA de malsamaj mezaj fragmentlongoj ĉeestis en la eltiraĵoj depende de la fiksa metodo. DNA estis konservita nur kiam fiksite en indiĝenaj frostaj provaĵoj kaj en bufrita neŭtrala formalino. La uzo de forte acida Bouin-fiksaĵo aŭ nebufrita, formiacida enhavanta formalino rezultigis signifan perdon de DNA. La restanta frakcio estas tre fragmenta.
Maldekstre, la longo de fragmentoj estas esprimita en kilobazparoj (kbp)

Figuro 2 | Perdo de integreco de nukleaj acidceloj
(a) 3′-5′ interspaco sur ambaŭ fadenoj rezultigos rompon en la cela DNA. sintezo de DNA ankoraŭ okazos sur la malgranda fragmento. Tamen, se enkonduka kalcia loko mankas sur la DNA-fragmento, nur linia plifortigo okazas. En la plej favora kazo, la fragmentoj povas resaturigi unu la alian, sed la rendimentoj estos malgrandaj kaj sub detektaj niveloj.
(b) Perdo de bazoj, ĉefe pro depurigo kaj timidina dimero-formado, kondukas al malkresko de la nombro da H-ligoj kaj malpliigo de Tm. Dum la plilongigita varmfazo, la enkondukoj degelos for de la matrica DNA kaj ne kalziĝos eĉ sub malpli striktaj kondiĉoj.
(c) Najbaraj timinbazoj formas TT-dimeron.
Alia ofta problemo kiu ofte okazas en molekula diagnozo estas la malpli-ol-optimuma liberigo de celaj nukleaj acidoj komparite kun fenol-kloroforma ekstraktado. En ekstremaj kazoj, ĉi tio povas esti asociita kun falsaj negativoj. Multe da tempo povas esti ŝparita per bolado de lizo aŭ enzimeca digestado de ĉelaj derompaĵoj, sed tiu metodo ofte rezultigas malaltan PCR-sentemon pro nesufiĉa liberigo de nuklea acido.

Inhibicio de polimeraza aktiveco dum plifortigo

Ĝenerale, inhibicio estas utiligita kiel kontenera koncepto por priskribi ĉiujn faktorojn kiuj kondukas al suboptimumaj PCR-rezultoj. En strikte biokemia signifo, inhibicio estas limigita al la agado de la enzimo, t.e., ĝi reduktas aŭ malhelpas substrat-produktan konvertiĝon per interagado kun la aktiva loko de la DNA-polimerazo aŭ ĝia kofaktoro (ekz., Mg2+ por Taq DNA-polimerazo).
Komponantoj en la provaĵo aŭ diversaj bufroj kaj eltiraĵoj enhavantaj reakciiloj povas rekte malhelpi la enzimon aŭ kapti ĝiajn kofaktorojn (ekz. EDTA), tiel malaktivigante la polimerazon kaj en victurno kondukante al malkreskintaj aŭ falsaj negativaj PCR-rezultoj.
Tamen, multaj interagoj inter reagkomponentoj kaj cel-enhavantaj nukleaj acidoj ankaŭ estas nomumitaj kiel "PCR-inhibitoroj". Post kiam la integreco de la ĉelo estas interrompita per izoliteco kaj la nuklea acido estas liberigita, interagoj inter la provaĵo kaj ĝia ĉirkaŭa solvo kaj solida fazo povas okazi. Ekzemple, "kadavromanĝantoj" povas ligi unu- aŭ duoble-senhelpan DNA per ne-kovalentaj interagoj kaj malhelpi izolitecon kaj purigon reduktante la nombron da celoj kiuj poste atingas la PCR-reagŝipon.
Ĝenerale, PCR-inhibitoroj ĉeestas en la plej multaj korpaj fluidoj kaj reakciiloj uzitaj por klinikaj diagnozaj testoj (ureo en urino, hemoglobino kaj heparino en sango), manĝaldonaĵoj (organikaj komponentoj, glikogeno, graso, Ca2+ jonoj) kaj komponentoj en la medio (fenoloj). , pezaj metaloj)

Pli ĝeneralaj PCR-inhibitoroj povas esti trovitaj en bakterioj kaj eŭkariotaj ĉeloj, ne-cela DNA, DNA-ligantaj makromolekuloj de histomatricoj kaj laboratoria ekipaĵo kiel ekzemple gantoj kaj plastoj. Purigado de nukleaj acidoj dum aŭ post ekstraktado estas la preferata metodo por forigi PCR-inhibitorojn.
Hodiaŭ, diversaj aŭtomatigitaj ekstraktaj ekipaĵoj povas anstataŭigi multajn manajn protokolojn, sed 100% reakiro kaj/aŭ purigo de celoj neniam estis atingitaj. Eblaj inhibitoroj ankoraŭ povas ĉeesti en la purigitaj nukleaj acidoj aŭ eble jam efikis. Malsamaj strategioj ekzistas por redukti la efikon de inhibitoroj. La elekto de la taŭga polimerazo povas havi signifan efikon al inhibitora aktiveco. Aliaj elprovitaj metodoj por redukti PCR-inhibicion pliigas polimerazkoncentriĝon aŭ aplikas aldonaĵojn kiel ekzemple BSA.
Inhibicio de PCR-reagoj povas esti pruvita per la uzo de interna proceza kvalitkontrolo (IPC).
Oni devas zorgi forigi ĉiujn reakciulojn kaj aliajn solvojn en la eltira ilaro, kiel etanolo, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanolo kaj fenolo, el la izolita de nuklea acido per profunda lava paŝo. Depende de ilia koncentriĝo, ili povas aktivigi aŭ malhelpi PCR.