Interferfaktoroj en PCR-reagoj

Dum la PCR-reakcio, ofte renkontiĝas iuj interferantaj faktoroj.
Pro la tre alta sentemo de PCR, poluado estas konsiderata unu el la plej gravaj faktoroj influantaj PCR-rezultojn kaj povas produkti falspozitivajn rezultojn.
Same kritikaj estas la diversaj fontoj, kiuj kondukas al falsnegativaj rezultoj. Se unu aŭ pluraj esencaj partoj de la PCR-miksaĵo aŭ la amplifika reakcio mem estas inhibiciitaj aŭ interrompitaj, la diagnoza analizo povas esti malhelpita. Tio povas konduki al reduktita efikeco kaj eĉ falsnegativaj rezultoj.
Aldone al inhibicio, perdo de la integreco de la cela nuklea acido povas okazi pro la kondiĉoj de transportado kaj/aŭ stokado antaŭ la preparado de la specimeno. Aparte, altaj temperaturoj aŭ neadekvata stokado povas kaŭzi damaĝon al ĉeloj kaj nukleaj acidoj. Ĉel- kaj histofiksado kaj parafina enkorpigo estas konataj kaŭzoj de DNA-fragmentiĝo kaj persista problemo (vidu Figurojn 1 kaj 2). En ĉi tiuj kazoj, eĉ optimuma izolado kaj purigo ne helpos.

Figuro 1 | Efiko de senmovigigo sur DNA-integrecon
Agaroza ĝela elektroforezo montris, ke la kvalito de la DNA izolita el parafinaj sekcioj de nekropsioj variis konsiderinde. DNA kun malsamaj averaĝaj fragmentlongoj ĉeestis en la ekstraktoj depende de la fiksadmetodo. DNA estis konservita nur kiam fiksita en indiĝenaj frostaj specimenoj kaj en bufrita neŭtrala formalino. La uzo de forte acida Bouin-fiksativo aŭ nebufrita, formikacido-entenanta formalino rezultigis signifan perdon de DNA. La restanta frakcio estas tre fragmentita.
Maldekstre, la longo de fragmentoj estas esprimita en kilobazaj paroj (kbp)

Figuro 2 | Perdo de integreco de nukleaacidaj celoj
(a) 3′-5′ breĉo sur ambaŭ fadenoj rezultigos rompon en la cela DNA. Sintezo de DNA ankoraŭ okazos sur la malgranda fragmento. Tamen, se mankas loko por alkroĉi la prajmerojn sur la DNA-fragmento, nur lineara amplifikado okazas. En la plej favora kazo, la fragmentoj povas resaturi unu la alian, sed la rendimentoj estos malgrandaj kaj sub la detektaj niveloj.
(b) Perdo de bazoj, ĉefe pro depuriniĝo kaj formado de timidinaj dimeroj, kondukas al malpliiĝo de la nombro de H-ligoj kaj malpliiĝo de Tm. Dum la plilongigita varmiĝa fazo, la prajmeroj forfandiĝos de la matrica DNA kaj ne kalciniĝos eĉ sub malpli striktaj kondiĉoj.
(c) Apudaj timinaj bazoj formas TT-dimeron.
Alia ofta problemo, kiu ofte okazas en molekula diagnozo, estas la malpli ol optimuma liberigo de celaj nukleaj acidoj kompare kun fenolo-kloroforma ekstraktado. En ekstremaj kazoj, tio povas esti asociita kun falsaj negativoj. Multe da tempo povas esti ŝparita per bolanta lizo aŭ enzima digestado de ĉelderompaĵoj, sed ĉi tiu metodo ofte rezultigas malaltan PCR-sentemon pro nesufiĉa liberigo de nukleaj acidoj.

Inhibicio de polimeraza aktiveco dum amplifikado

Ĝenerale, inhibicio estas uzata kiel ujo-koncepto por priskribi ĉiujn faktorojn, kiuj kondukas al suboptimalaj PCR-rezultoj. En strikte biokemia senco, inhibicio estas limigita al la aktiveco de la enzimo, t.e., ĝi reduktas aŭ malhelpas substrato-produktan konvertiĝon per interagado kun la aktiva loko de la DNA-polimerazo aŭ ĝia kofaktoro (ekz., Mg2+ por Taq DNA-polimerazo).
Komponantoj en la specimeno aŭ diversaj bufroj kaj ekstraktoj enhavantaj reakciilojn povas rekte inhibicii la enzimon aŭ kapti ĝiajn kofaktorojn (ekz. EDTA), tiel malaktivigante la polimerazon kaj siavice kondukante al malpliiĝintaj aŭ falsnegativaj PCR-rezultoj.
Tamen, multaj interagoj inter reakciaj komponantoj kaj cel-entenantaj nukleaj acidoj ankaŭ estas nomitaj "PCR-inhibiciiloj". Post kiam la integreco de la ĉelo estas interrompita per izolado kaj la nuklea acido estas liberigita, interagoj inter la specimeno kaj ĝia ĉirkaŭa solvaĵo kaj solida fazo povas okazi. Ekzemple, "kadavromanĝantoj" povas ligi unu- aŭ duoble-fadenan DNA-on per ne-kovalentaj interagoj kaj interrompi izoladon kaj purigon reduktante la nombron da celoj, kiuj poste atingas la PCR-reakcian ujon.
Ĝenerale, PCR-inhibiciiloj ĉeestas en plej multaj korpaj fluidoj kaj reakciiloj uzataj por klinikaj diagnozaj testoj (ureo en urino, hemoglobino kaj heparino en sango), manĝaldonaĵoj (organikaj komponantoj, glikogeno, graso, Ca2+-jonoj) kaj komponantoj en la medio (fenoloj, pezaj metaloj).

Pli oftaj PCR-inhibiciiloj troveblas en bakterioj kaj eŭkariotaj ĉeloj, necela DNA, DNA-ligantaj makromolekuloj de histaj matricoj kaj laboratoria ekipaĵo kiel gantoj kaj plastoj. Purigado de nukleaj acidoj dum aŭ post ekstraktado estas la preferata metodo por forigi PCR-inhibiciilojn.
Hodiaŭ, diversaj aŭtomataj ekstraktaj ekipaĵoj povas anstataŭigi multajn manajn protokolojn, sed 100%-a reakiro kaj/aŭ purigo de celoj neniam estis atingita. Eblaj inhibitoroj eble ankoraŭ ĉeestas en la purigitaj nukleaj acidoj aŭ eble jam ekvalidis. Ekzistas diversaj strategioj por redukti la efikon de inhibitoroj. La elekto de la taŭga polimerazo povas havi signifan efikon sur la inhibitora aktiveco. Aliaj pruvitaj metodoj por redukti PCR-inhibicion estas pliigi la koncentriĝon de polimerazo aŭ apliki aldonaĵojn kiel BSA.
Inhibicio de PCR-reagoj povas esti montrita per la uzo de interna proceskvalitkontrolo (IPC).
Oni devas zorgi forigi ĉiujn reakciilojn kaj aliajn solvaĵojn en la ekstrakta ilaro, kiel etanolo, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanolo kaj fenolo, el la nukleaacida izolitaĵo per kompleta lava paŝo. Depende de ilia koncentriĝo, ili povas aktivigi aŭ inhibicii PCR.